Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza modyfikowane chitozanem: projektowanie, wytwarzanie, opis i działanie przeciwbakteryjne

Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza modyfikowane chitozanem: projektowanie, wytwarzanie, opis i działanie przeciwbakteryjne
Fot. Adobe Stock. Data dodania: 20 września 2022

Wprowadzenie

Kompozyty, to układy wielofazowe, w których o właściwościach makroskopowych decydują oddziaływania międzyfazowe. Zainteresowanie tymi materiałami wzrosło w ostatnim czasie z uwagi na fazę rozproszoną, utworzoną przez nanocząstki metali lub tlenków metali w osnowie, która może być amorficzna lub krystaliczna. Układy te, zwykle określane terminem nanokompozyty (NC), zyskują na zainteresowaniu ze względu na oddziaływania fizyczne w heteropołączeniach dwóch faz, które mogą decydować o lepszych właściwościach fizycznych i mechanicznych [1].

Chitozan (CTS) otwiera nowe obiecujące pola badań jako cenna naturalna osnowa polimerowa ze względu na jego doskonałe właściwości chemiczne i biologiczne. Jest to polimer kationowy hydrofilowy, który jest również nietoksyczny, biokompatybilny, biodegradowalny, biochłonny i ma właściwości przeciwbakteryjne [2, 3] przez co stał się w ostatnich latach popularnym materiałem w zastosowaniach medycznych, ale dopiero niedawno stosowany jest w połączeniu z nanocząstkami magnetycznymi [4]. Chitozan jest słabą zasadą nierozpuszczalną w wodzie, ale rozpuszczalną w rozcieńczonych kwaśnych roztworach wodnych poniżej swojego pKa (~6,3), kiedy to grupy (-NH2) mogą być przekształcone w pro- tonowaną postać rozpuszczalną (-NH3+) [5]. Film chitozanu uważany jest za materiał biofunkcyjny, dobrze tolerowany przez żywe tkanki, stosowany w szczególności jako jadalna osłonka do żywności przedłużająca jej przydatność do spożycia i utrzymująca jej jakość [6]. W medycynie film chitozanu testowano jako opatrunek leczniczy na rany i jako skafoldy w inżynierii tkanek i kości [7]. Chitozan badano w różnych postaciach (roztwory, filmy i kompozyty) jako materiał przeciwmikrobiologiczny działający na szerokie spektrum organizmów docelowych, takich jak glony, bakterie, drożdże i inne grzyby mikroskopowe w doświadczeniach in vivo i in vitro. Pierwsze badania nad potencjałem antymikrobiologicznym chitozanu i jego pochodnych przeprowadzono w latach 80. i 90. ubiegłego wieku [8]. Właściwości antymikrobiologiczne chitozanu różnią się w zależności od próbki materiału włóknistego. Chitozan wchłaniany jest przez włóknistą strukturę celulozy/białka z powodu oddziaływań jonowych między ładunkami ujemnymi i protonowanymi grupami aminowymi chitozanu (-NH3+), wiązań wodorowych i sił van der Waalsa. Jednak jego powinowactwo można ogólnie określić jako słabe. W związku z tym jego działanie antymikrobiologiczne jest słabe, gdy stosowany jest samodzielnie [9^11]. Chitozan oddziałuje łatwo na bakterie i wiąże się z DNA, glikozaminoglikanami i większością białek, przez co wzmacnia efekt antymikrobiologiczny na- nocząstek [12].

Nanocząstki (NP) tlenków metali wykazują wybitne właściwości elektryczne, optyczne, magnetyczne itd., których nie mają w postaci tradycyjnej [13]. Nanocząstki magnetytu wykazują wiele ciekawych i wyjątkowych właściwości. Stosowano je w różnych dziedzinach, takich jak kataliza, fotomagnetyzm, magnetooptyka, czujniki, przechowywanie danych, drukarki atramentowe, urządzenia częstotliwości wysokiej i radiowej, hypotermia, systemy dostarczania leków, obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), diagnostyka medyczna i leczenie raka. Magnetyczne nanocząstki zbudowane z magnetytu (Fe3O4) mają wyjątkowe właściwości czyniące z nich obiecujące środki do zastosowań przeciwbakteryjnych [14], tym bardziej, że amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration) uznała, że superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza (SPIONP) są biokompatybilne (BC) z ludzkim ciałem

[15] . Doprowadziło to do szybkiego wzrostu liczby publikacji naukowych poświęconych opracowywaniu metod sporządzania jednorodnych i stabilnych wodnych zawiesin Fe3O4 i bliższemu poznaniu ich właściwości. Fascynujące właściwości nanomagnetytów zależą silnie od wielkości i kształtu nanocząstek, ich oddziaływaniu ze stabilizatorami, czynnikami otaczającymi, a także od sposobu ich otrzymywania

. Ciekawe jest, że tylko cząstki magnetytu o wielkości poniżej 30 nm mają dużą powierzchnię i wykazują właściwości superparama- gnetyczne, które czynią je podatnymi na działanie pól magnetycznych i powodują, że nie ulegają trwałemu namagnesowaniu bez zewnętrznego pola magnetycznego. Z tego względu kontrolowana synteza nanokryształów stanowi kluczowe wyzwanie na drodze do uzyskania lepszych właściwości. Spośród kilku opracowanych eksperymentalnych dróg syntezy nanocząstek tlenków żelaza [17], niektóre wymagają stosowania rozpuszczalników organicznych i wysokich temperatur - warunków, które są niezgodne z hydrofilowym charakterem i właściwościami termicznymi większości naturalnych polisacharydów. W związku z tym wspomagane polisacharydami otrzymywanie SPIONP realizowane jest przeważnie na drodze chemicznej wymagającej łagodnych warunków, takiej jak metoda współstrącania. Metoda ta polega zasadniczo na współstrącaniu stechiometrycznej mieszaniny soli żelazowych i żelazawych w środowisku wodnym w warunkach zasadowych i przy braku dostępu tlenu [18]. Dlatego od niedawna współstrącanie z roztworu mieszanych soli żelazowych/ żelazawych w środowisku alkalicznym stało się szeroko stosowane do otrzymywania SPIONP [19]. Wielkość i kształt nanocząstek można kontrolować za pomocą regulacji pH, mocy jonowej, temperatury i rodzaju soli [20, 21]. W kontrolowaniu wielkości nanocząstek może pomagać dodatek organicznych anionów chelatujących lub polime- rycznych środków kompleksujących w czasie formowania magnetytu [22]. Zatem dodatki odgrywają zasadniczą rolę w zabezpieczeniu zsyntezowanych cząstek przed nagłą flokulacją, hamując aglomerację cząstek [23]. Te nanocząstki ulegają aglomeracji wskutek dużej powierzchni właściwej, energii powierzchniowej i magnetyzacji. Jedną z najlepszych strategii ograniczania aglomeracji cząstek i poprawy rozkładu wielkości i morfologii nanocząstek, jest pokrywanie magnetytowych nanocząstek środkiem powierzchniowo czynnym, takim jak chitozan. Chitozan o dużej zawartości grup aminowych (-NH2) może tworzyć kompleksy z metalami, udostępniając powierzchnię do łączenia się z magnetycznymi nanocząstkami [24]. Magnetyczne nanocząstki o średniej średnicy od 14 nm [25] do 30 nm [26] pokryte chitozanem otrzymano na drodze współstrącania.

Pojawienie się w ostatnim dziesięcioleciu oporności i wieloopor- ności na substancje antymikrobiologiczne wzmogło zainteresowanie w poszukiwaniu nowych środków antymikrobiologicznych i opracowywaniu nowych strategii leczenia chorób zakaźnych [27]. Co za tym idzie, wzrosło w ostatnich latach zainteresowanie poszukiwaniem środków alternatywnych wobec antybiotyków [28, 29]. Konieczne jest zatem znalezienie alternatywnej terapii zakażenia mikrobiologicznego bez użycia antybiotyków, skierowanej na ognisko infekcji, zlokalizowanej i utrudniającej bakteriom uzyskanie oporności [30]. Podążając w tym kierunku, niektórzy badacze postawili hipotezę, że indywidua chemiczne zawierające aktywny tlen (ROS) wytwarzane przez nano- cząstki Fe3O4 mogłyby zabijać bakterie bez uszkadzania komórek nie- bakteryjnych [31]. W szczególności Pareta i wsp. hodowali osteoblasty (komórki kościotwórcze) z nanocząstkami tlenku żelaza (IONP) o stężeniu 4,25 mg/ml i stwierdzili, że gęstość komórek wzrastała w obecności IONP [32].

Spośród bakterii Gram-ujemnych Pseudomonas aeruginosa (P aeru- ginosa) i Escherichia coli (E. coli) najczęściej uczestniczą w infekcjach spowodowanych wytworzeniem biofilmu. Infekcje z występowaniem biofilmu charakteryzują się większą opornością - w porównaniu z komórkami planktonicznymi - na antybiotyki i środki odkażające, jak i na fagocytozę i inne elementy układu odpornościowego człowieka [33]. P. aeruginosa stanowi podstawowy czynnik wywołujący zakażenia szpitalne i odpowiada za 10% zakażeń wewnątrzszpitalnych [34]. Jest on również najpospolitszym źródłem zakażeń ran oparzeniowych[ 35]. E. coli to ważny patogen wywołujący 80 do 90% pozaszpitalnych zakażeń dróg moczowych (UTI) i ponad 30% UTI szpitalnych [36^38].

W niniejszej pracy opisano uniwersalną, skuteczną i jednoetapową technikę otrzymywania dokładnie zdyspergowanych zawiesin wodnych koloidów superparamagnetycznych tlenków żelaza (SPIO) metodą współstrącania. CTS pełni rolę środka zabezpieczającego i matrycującego i umożliwia otrzymywanie biokompatybilnych nanokompozytów SPIO/CTS (SPIO/CTS BCNC) bez stosowania środków powierzchniowo czynnych. Ta ścieżka syntezy jest ekologiczna ze względu na stosowanie chemikaliów nietoksycznych i brak obróbki termicznej. SPIO/CTS BCNC mogą występować w postaci bardzo stabilnej dyspersji wodneji wykazują doskonałą aktywność przeciwbakteryjną w stosunku do bakterii Gram-ujemnych P. aeruginosa i E. coli, więc SPIO/CTS BCNC stosowany jest jako powłoka odporna na bakterie i ochrona przeciwbakteryjna do urządzeń biomedycznych.

Część doświadczalna

Materiały

Wszystkie stosowane w pracy odczynniki były czystości analitycznej i używane w stanie otrzymanym bez dodatkowego oczyszczania. Do sporządzenia SPIO/CTS BCNC używano następujących materiałów: CTS (Aldrich, niska m.cz., lepkość Brookfielda 20 cPs), FeCly4H2O, FeCl36H2O, kwas octowy cz., wodorotlenek amonu roztwór 25% (Merck) i wodorotlenek tetrametyloammoniowy (TMAOH) 25% roztwór wodny (Aldrich). Stosowano podwójnie destylowaną wodę (woda DD) po usuwaniu tlenu azotem przez 10 min.

Otrzymywanie SPIO/CTS BCNC

W typowej procedurze określoną ilość CTS rozpuszczano w 100 ml 1% roztworu kwasu octowego, następnie zmieszano 17,4 ml tego roztworu, 0,2 ml 1 M FeCl2 i 0,4 ml 1 M FeCl3 uzyskując roztwór chlorków żelaza o stężeniu CTS 0,05%(w/v). Mieszaninę mieszano energicznie strumieniem pęcherzyków N2 wprowadzanych przez pipetę w temperaturze pokojowej. Utrzymywano pH mieszaniny równe 6,9 wkraplając z biurety roztwór 0,8M wodorotlenku amonu. Powolne dodawanie ma zasadnicze znaczenie przy otrzymywaniu jednolitej, czarnej, stabilnej wodnej zawiesiny koloidalnej. Otrzymany produkt odwirowano kilkakrotnie z wody DD, a następnie z etanolu i suszono pod próżnią w 70°C. Z SPIO/CTS BCNC w postaci stałej można łatwo

uzyskać zawiesinę w wodzie DD do badania właściwości. Tę samą procedurę zastosowano dodając TMAOH ((CH3)4NOH) zamiast CTS jako środek powierzchniowo czynny w celu uzyskania nieopłaszczonego SPIONP oczyszczano tak jak wyżej i wzięto do badań antybakteryjnych do porównania.

Testy przeciwbakteryjne

Działanie przeciwbakteryjne sprawdzono wobec dwóch patogenicznych szczepów bakterii Gram-ujemnych P. aeruginosa (ATCC 27853) i E. coli (ATCC 25922). Każdy z dwóch patogenicznych szczepów bakterii zaszczepiono na pożywce - agarze Mueller Hinton (MH) o pH równym 7,3, na którym dobrze się rozmnażały. Hodowlę inkubowano przez 24 h w 37°C. Następnie sporządzono próbkę wzorcową zawiesiny nr 0.5 McFarland Standard, która jest równoważna 1,5 X 108 CFU.ml"1. Zastosowano standardową mikrometodę rozcieńczania przy wykonywaniu testów działania przeciwbakteryjnego na płytkach z MH zgodnie z poprzednim raportem [1].

Dyspersje wodne SPIO lub SPIO/CTS BCNC o różnych stężeniach otrzymano z wyjściowych roztworów koloidalnych magnetytu lub magnetytu i CTS. Dla uzyskania jednorodnego rozkładu pożywkę MH ogrzano do 50°C. Następnie przeniesiono po 10 ml każdego z roztworów SPIO lub SPIO/CTS BCNC na płytki Petrie- go zawierające 25 ml pożywki MH. Całkowita objętość na każdej płytce Petriego wynosiła 35 ml, a mieszany roztwór zestalał się pod wpływem MH po 15 min. Następnie pobierano pipetą 100 /ul zawiesiny bakterii i rozprowadzano na powierzchni pożywki MH zawierającej SPIO lub SPIO/CTS BCNC. Płytki Petriego umieszczano na 24 h w inkubatorze z funkcją wytrząsania (150 obr/min) w temp. 37°C. Porównywano wyniki rozwoju bakterii na płytkach z MH z i bez SPIO lub SPIO/CTS BCNC. W celu ilościowego oznaczenia aktywności przeciwbakteryjnej SPIO i SPIO/CTS BCNC dokonano obliczenia liczby CFU uzyskanych po dodaniu zawiesiny bakterii o mniejszym stężeniu (103 lub 104 CFU) na pożywce MH zmieszanej z koloidami SPIO i SPIO/CTS BCNC o różnych stężeniach. Badano również próbkę kontrolną w celu porównania. Wszystkie doświadczenia wykonywano po trzy razy w warunkach jałowych. Procentowe zmniejszenie liczby komórek bakteryjnych do ilościowej oceny aktywności przeciwbakteryjnej obliczano jako: wzór 1.
gdzie: R oznacza procentowe zmniejszenie liczby kolonii; A - liczbę kolonii bakterii na płytkach Petriego bez SPIO lub SPIO/CTS BCNC; B - liczbę kolonii bakterii na płytkach Petriego z SPIO lub SPIO/CTS BCNC.

Działanie przeciwbakteryjne in vitro próbek stałych oceniano metodą dyfuzyjno-krążkową stosując MH i określano średnicę strefy inhibicji w milimetrach, zgodnie z normami zalecanymi przez Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST). Oznaczano krawędzie stref jako punkty, w których nie stwierdzano wzrostu bakterii patrząc na spód płytki na ciemnym tle oświetlonym światłem odbitym [39]. Przeanalizowano działanie przeciwbakteryjne cienkich filmów SPIO i SPIO/CTS BCNC wobec bakterii P aeruginosa (ATCC 27853) i E. coli (ATCC 25922). W celu odtworzenia zliofilizowanej kultury przeniesiono ją aseptycznie w plastycznej fiolce do probówki zawierającej 5 ml bulionu odżywczego i wstawiano do inkubatora w 37°C na 24 godziny w przypadku bakterii i w 25°C na 72 godziny w przypadku cienkich filmów. Wyjściowe stężenie hodowli dpowiadało próbce zawiesiny McFarland Standard nr 0.5 dla każdej z bakterii, co oznaczano za pomocą testu z płytką ze stałym agarem. Płytki celulozowe (krążki o średnicy 6 mm) pokryte cienkimi filmami CTS, SPIO i SPIO/CTS BCNC wyjaławiano przez zanurzenie w etanolu przez 15 minut i umieszczano na powierzchni MH zaszczepionego 1,0 ml hodowli mikroorganizmów. Płytki utrzymywano w 37°C przez 24 godziny. Średnice strefy inhibicji próbek filmu używano do określenia działania przeciwmikrobiologicznego każdej próbki filmu biorąc średnią z trzech oznaczeń. W tym badaniu do porównania brano krążek ze standardowym antybiotykiem cyprofloksacyną (CIP) umieszczoną na powierzchni MH.

Metody badania właściwości

Rozwój bakterii na płytkach z MH z CTS, z samym SPIO i z SPIO/ CTS BCNC o różnych stężeniach kontrolowano za pomocą mikroskopu Olympus CX 31. Spektrogramy fourierowskie w podczerwieni (FTIR) uzyskano za pomocą aparatu BOMEM MB-Series w zakresie od 400 cm"1 do 4000 cm-1 w temperaturze pokojowej. Próbki sporządzono umieszczając kroplę wodnego koloidalnego roztworu magnetytu na KBr, który suszono w temperaturze pokojowej.

Do określenia średniej wielkości cząstek i morfologii proszku na- nokompozytu używano skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) LEO-435-VP SEM pracującego przy napięciu przyspieszającym 18 kV Badanie mikroskopią elektronową transmisyjną (TEM) w celu obserwacji morfologii i analizy wielkości cząstek Fe3O4 w NC przeprowadzono za pomocą aparatu Philips CMI0 przy napięciu 100 kV Średnią wielkość cząstek dyspersji koloidalnych magnetytu oznaczono na podstawie analizy obrazów z TEM. Próbki do badania TEM sporządzono umieszczając kroplę wodnego koloidalnego roztworu magnetytu na siatce miedzianej pokrytej węglem, którą suszono w temperaturze pokojowej. Obraz dyfrakcyjny promieni rentgenowskich (XRD) na powierzchni kryształów magnetytu uzyskano z filmów osadzonych na szkle, na które nałożono roztwór koloidalny magnetytu w zakresie 29 10-80° na aparacie Philips X'pert (promieniowanie Cu Ka (X = 0,154 nm), 30 mA, 40 kV). Prędkość kano- wania w temperaturze pokojowej 0,05 29.s-1. Nanocząstki zawsze wykazują wysoką krystaliczność. Badano najsilniejsze piki Fe3O4/CTS BCNC odpowiadające płaszczyźnie (311) w celu oceny krystaliczno- ści próbki. Średnią wielkość L nanokryształu oznaczono na podstawie rozszerzenia |3 najintensywniejszej linii w obrazie XRD. Wielkość obliczono dla nanokryształu z równania Scherrera: wzór 2.

Właściwości magnetyczne wysuszonych nanocząstek określono za pomocą magnetometru ze zmiennym gradientem pola (AGFM, MDK Corporation) w temperaturze pokojowej.

Wyniki i dyskusja

Analiza chemiczna FTIR

Widma FTIR CTS i SPIO/CTS BCNC przedstawiono na Rysunek I. Widmo czystego CTS jasno wskazuje, że obserwowane piki absorpcji odpowiadają charakterystykom wiązań chemicznych występujących w CTS. Główne pasma pojawiające się w tym widmie pochodzą od drgań rozciągających grup OH w zakresie od 3750 cm-1 do 3000 cm-1, na które zachodzą pasma pochodzące od drgań rozciągających wiązań N-H i C-H odpowiednio w grupie -CH2 (2922 cm-1) i -CH3 (2875 cm-1) [41].

Charakterystyczne pasma absorpcyjne 1659 cm-1 i 1602 cm-1 pochodzą od absorpcji odpowiednio amidu I (asymetryczne drgania rozciągające grup karbonylowych amidu) i amidu II (drgania zginające w płaszczyźnie N-H w grupach amidowych) [42]. Widoczne były również drgania zginające grup metylenowych i metylowych odpowiednio przy 1383 cm-1 i 1425 cm-I[4I]. Absorpcję w zakresie od 1160 cm-1 do 1000 cm-1 przypisano drganiom grupy CO [43], wyraźny pik 1162 cm-1 jest w obszarze drgań rozciągających C-O-C grup eterowych i szkieletowych reszty glukozaminowej [44^47]. Pasma w okolicach 1080-1029 cm-1 przypisuje się drganiom uCO pierścienia COH, COC i CH2OH [48]. Mały pik ~890 cm-1 odpowiada drganiom wachlarzowym struktury sacharydowej chitozanu [49, 50].

Jednak pasmo uległo przesunięciu z 1162 cm-1 do 1064 cm-1 w widmie nanocząstek SPIO/CTS. To samo dotyczy pasm 1383 cm-1 i 1425 cm-1 do 1400 cm-1. Z drugiej strony absorpcja amidu w zakresie od 1650 cm-1 do 1640 cm-1 wzmocniła się w stosunku do widm czystego CTS. Wydaje się, że zjawiska te spowodowane są oddziaływaniami między atomem tlenu w nanocząstkach Fe3O4 i atomem wodoru w grupie aminowej CTS i utworzeniem silnego wiązania wodorowego, co jest przyczyną silniejszego pasma absorpcji amidu w widmach nanocząstek SPIO/CTS (Rys. I). Należy zauważyć, że grupa hydroksylowa CTS nie związała się z nanocząstkami i nie spowodowała przesunięcia ani zmian, co widać na widmach CTS i nanocząstek SPIO/CTS. Z tego względu ładunek dodatni na atomie wodoru w polarnym wiązaniu -O-H+ w CTS może być przyczyną występowania ładunku dodatniego na powierzchni nanocząstek [5I]. Dzięki odpychaniu kulombowskiemu między dodatnio naładowanymi cząstkami w doświadczeniu utworzona została czarna stabilna wodna zawiesina koloidalna bez zastosowania jakiegokolwiek środka powierzchiowo czynnego. Rdzeń/otoczkę Fe3O4/chitozan i powstawanie wiązania wodorowego przedstawiono schematycznie na Rysunek 2.

Y. Wang i wsp. wskazali, że główny pik 399,5 eV w widmie rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów kompozytu SPIO/CTS sporządzonego przez niego i współpracowników należy przypisać grupom aminowym uczestniczącym w wiązaniu wodorowym (NH2-O) [52]. Dwa wyraźne piki absorpcyjne 583 i 477 cm-1 przypisuje się odpowiednio drganiom Fe2+-O2- i Fe3+-O2-. Ostry i silny pik 583 cm-1 świadczy o wysokim stopniu krystaliczności nanocząstek Fe3O4. Charakterystyczne pasma absorpcji potwierdzają zatem obecność struktury spinelowej Fe3O4 [53].

Morfologia Fe3O4/CTS BCNC

Mikrostrukturę i morfologię zsyntezowanych cząstek Fe3O4 zawartych w koloidalnym nanokompozycie badano za pomocą SEM (Rys. 3). Dalsza analiza obrazu SEM zsyntezowanych nanocząstek wykazała jednorodne nanocząstki Fe3O4 o dużej gęstości, prawie kuliste, o przeciętnej średnicy 22,0 nm, co jest zgodne z wynikami analiz XRD i TEM.

Mikrostrukturę cząstek Fe3O4 zawartych w koloidalnym nanokompozycie badano za pomocą TEM (Rys. 4). Nanocząstki Fe3O4/CTS mają kształt prawie kulisty, co potwierdziły badania skaningowym mikroskopem elektronowym. Wszystkie nanocząstki były dobrze oddzielone od siebie, nie obserwowano aglomeracji, wykazywały strukturę odwróconego spinelu, czego potwierdzeniem są piki obecne w widmach XRD. Po zbadaniu fotomikrografii zmierzono rozkład średnic w zakresie 9-32 nm, przy średniej wartości 22,0 nm (odchylenie standardowe ok. 7,8 nm) średnicy cząstek nanokompozytów, jak pokazano we wstawce na Rysunku 4. Podczas przechowywania nie zaobserwowano agregacji ani wytrącania, co jest wynikiem odpychania elektrostatycznego dodatnio naładowanych nanocząstek.

Analiza rentgenowska dyfrakcyjna

Inną ciekawą kwestią w syntezie nanocząstek jest ich charakter krystaliczny i najczęściej występujące układy krystalograficzne. Istotne jest również, by koloid zawierał głównie nanocząstki SPIO. Na Rysunku 5 pokazano obraz XRD cząstek SPIO/CTS BCNC. W dyfraktogramie jest siedem wyraźnych pików dyfrakcyjnych
0 wartościach 29 równych 30,3°, 35,5°, 43,2°, 53,5°, 57°, 62,7°
1 74,5°, które odpowiadają płaszczyznom krystalograficznym (220), (311), (400), (422), (511), (440) i (533) kryształu magnetytu o strukturze odwróconego spinelu.

Odpowiadały one pikom dyfrakcyjnym czystego magnetytu (Fe3O4) z referencyjnej bazy danych (JCPDS File No. 19-629). Średnią wielkość krystalitu oszacowano na podstawie rozszerzenia linii dyfrakcyjnej (d3||) stosując równanie Scherrera. Średnia wielkość krystalitów Fe3O4 otrzymanych z nanokompozytu wynosiła 21 nm. Choć obliczenia ze wzoru Scherrera zwykle zaniżają rzeczywistą wielkość krystalitów, uzyskana wartość jest bardzo zbliżona do wyniku TEM, zatem każda cząstka powinna stanowić pojedynczy kryształ [54]. Stała sieciowa Fe3O4 wynosi 8,378, co jest bliskie wartości a=8,384 wzorca (JCPDS 75-0033). Obrazy XRD wskazują, że nanocząstki magnetytu są doskonale krystaliczne.

Wyniki pomiarów magnetycznych

Właściwości magnetyczne wysuszonych nanocząstek określono za pomocą magnetometru ze zmiennym gradientem pola (AGFM, MDK Corporation) w temperaturze pokojowej w zakresie pomiędzy -I0k a l0kOe. Wyniki wyraźnie wskazują na zachowanie superparamagnetyczne nanocząstek (Rys. 6). Wartość nasycenia magnetycznego (Ms) zasadniczej fazy magnetytu wynosi ok. 90-92 emu/g [55, 56], ale tu wartość Ms wynosi 65 emu/g. Różnicę można najprawdopodobniej przypisać kilku czynnikom, w tym efektowi ostatecznej wielkości i wysokiemu stosunkowi powierzchni do objętości, efektowi odchylenia spinu na granicy ziaren, niepełnej krystalizacji cząstek magnetytu [57] i obecności materiałów powleczonych [58], które mogą prowadzić do obniżenia efektywnego momentu magnetycznego. Zgodnie z przewidywaniami, z powodu pokrycia CTS, nasycenie magnetyczne nanocząstek było mniejsze niż w przypadku fazy objętościowej magnetytu. Zgodnie z wynikami AGFM (Rys. 6), pomijalnie mała koercja nanocząstek SPIO wykazywała właściwości materiałów superparamagnetycz-nych. Wysoka magnetyzacja i właściwości superparamagnetyczne są bardzo pożądane w zastosowaniach biomedycznych, ponieważ większe cząstki magnetyczne tworzą agregaty po poddaniu działaniu pola magnetycznego [59].

Wyniki badania działania przeciwbakteryjnego

W równoległych doświadczeniach zbadano działanie przeciwbak- teryjne samych cząstek SPIO i SPIO/CTS BCNC wobec wybranych gatunków bakterii. W celu oceny jakościowej działania przeciwbakteryjnego nanocząstek, zaszczepiono zawiesiną bakterii 1,5 X I08 CFU płytki z MH zawierające nanocząstki SPIO i SPIO/CTS BCNC w różnym stężeniu. Wyniki stanowią obserwacje bakterii hodowanych na płytkach MH po 24 godzinach przy różnych stężeniach nanocząstek SPIO i SPIO/CTS BCNC wynoszących 0, 75, 125, 175 i 225 pg.mH. W próbce kontrolnej (0 Ugml-I SPIO, 0,05% w/v CTS w 1% roztworze kwasu octowego) bakterie namnażały się łatwo, natomiast nie było widocznego rozwoju bakterii na płytkach z agarem po 24 godzinach przy różnych stężeniach nanocząstek SPIO i SPIO/CTS BCNC. W dalszych doświadczeniach określono minimalne stężenie hamujące (MIC) nanocząstek SPIO wobec P. aeruginosa i E. coli na odpowiednio 7Qug. ml-1 i 90 jUg.ml-1, a SPIO/CTS BCNC wobec P. aeruginosa i E. coli odpowiednio 40 jUg.ml-1 i 45 jUg.ml-1. W naszych doświadczeniach wartość MIC dla próbki kontrolnej wyniosła 1000 jUg.ml-1 (CTS, 0,1% w/v) dla E. coli [60-62] i 1700 jUg.ml-1 (CTS, 0.17 % w/v) dla P aeruginosa [61]. Jak wspomniano wcześniej, działanie antymikrobiologiczne CTS jest słabe, gdy stosowany jest on samodzielnie[9-II].

Mechanizm hamowania rozwoju bakterii przez CTS polega na tym, że naładowane dodatnio grupy aminowe mogą łączyć się z elementami anionowymi, takimi jak kwas N-acetylomuraminowy, kwas sialowy czy kwas neuraminowy, na powierzchni komórki i utrudniać wymianę z medium chelatujących jonów metali przejściowych, a także wpływać na inhibicję enzymów [61].

Jak wspomniano wyżej, gdy zawartość magnetytu w nanokompo- zycie była równa 40 jUg.ml-1 i 45 jUg.ml-1 odpowiednio dla P aeruginosa i E. coli, to obserwowano całkowite zahamowanie rozwoju bakterii. Przy tych i wyższych stężeniach nie stwierdzano widocznego rozwoju bakterii. Wyniki te wykazały, że optymalne warunki dla skutecznego hamowania rozwoju bakterii występowały przy stężeniach SPIO/CTS BCNC równych 40 jUg.ml-1 i 45 Ug. ml-1 odpowiednio dla P aeruginosa i E. coli. Ciekawe jest to, że stężenie koloidu Fe3O4 wystarczające do zahamowania rozwoju bakterii w naszej pracy jest zauważalnie niższe od podawanego w raportach innych badaczy[63-66].

Ten podwyższony potencjał przeciwbakteryjny prawdopodobnie spowodowany jest większą stabilnością naszego SPIO/CTS BCNC w środowisku wodnym wynikającą z ochrony przeciw agregacji, jaką CTS daje nanocząstkom SPIO. Doskonałe działanie przeciwbakteryjne w stosunku do zastosowanych gatunków bakterii, nawet przy niskim stężeniue3O4, obserwowane w otrzymanych roztworachkoloidalnych SPIO/CTS BCNC, czyni te ostatnie idealnymi do nowych ekonomicznych zastosowań przemysłowych o długotrwałym działaniu.

W równoległych doświadczeniach zbadano działanie przeciwbak- teryjne samych cząstek SPIO i SPIO/CTS BCNC wobec wybranych gatunków bakterii. W celu oceny jakościowej działania przeciwbakteryjnego nanocząstek, zaszczepiono zawiesiną bakterii 1,5 X I08 CFU płytki z MH zawierające nanocząstki SPIO i SPIO/CTS BCNC w różnym stężeniu. Wyniki stanowią obserwacje bakterii hodowanych na płytkach MH po 24 godzinach przy różnych stężeniach nanocząstek SPIO i SPIO/CTS BCNC wynoszących 0, 75, 125, 175 i 225 pg.mH. W próbce kontrolnej (0 Ugml-I SPIO, 0,05% w/v CTS w 1% roztworze kwasu octowego) bakterie namnażały się łatwo, natomiast nie było widocznego rozwoju bakterii na płytkach z agarem po 24 godzinach przy różnych stężeniach nanocząstek SPIO i SPIO/CTS BCNC. W dalszych doświadczeniach określono minimalne stężenie hamujące (MIC) nanocząstek SPIO wobec P. aeruginosa i E. coli na odpowiednio 7Qug. ml-1 i 90 jUg.ml-1, a SPIO/CTS BCNC wobec P. aeruginosa i E. coli odpowiednio 40 jUg.ml-1 i 45 jUg.ml-1. W naszych doświadczeniach wartość MIC dla próbki kontrolnej wyniosła 1000 jUg.ml-1 (CTS, 0,1% w/v) dla E. coli [60-62] i 1700 jUg.ml-1 (CTS, 0.17 % w/v) dla P aeruginosa [61]. Jak wspomniano wcześniej, działanie antymikrobiologiczne CTS jest słabe, gdy stosowany jest on samodzielnie[9-II].

Mechanizm hamowania rozwoju bakterii przez CTS polega na tym, że naładowane dodatnio grupy aminowe mogą łączyć się z elementami anionowymi, takimi jak kwas N-acetylomuraminowy, kwas sialowy czy kwas neuraminowy, na powierzchni komórki i utrudniać wymianę z medium chelatujących jonów metali przejściowych, a także wpływać na inhibicję enzymów [61].

Jak wspomniano wyżej, gdy zawartość magnetytu w nanokompo- zycie była równa 40 jUg.ml-1 i 45 jUg.ml-1 odpowiednio dla P aeruginosa i E. coli, to obserwowano całkowite zahamowanie rozwoju bakterii. Przy tych i wyższych stężeniach nie stwierdzano widocznego rozwoju bakterii. Wyniki te wykazały, że optymalne warunki dla skutecznego hamowania rozwoju bakterii występowały przy stężeniach SPIO/CTS BCNC równych 40 jUg.ml-1 i 45 Ug. ml-1 odpowiednio dla P aeruginosa i E. coli. Ciekawe jest to, że stężenie koloidu Fe3O4 wystarczające do zahamowania rozwoju bakterii w naszej pracy jest zauważalnie niższe od podawanego w raportach innych badaczy[63-66].

Ten podwyższony potencjał przeciwbakteryjny prawdopodobnie spowodowany jest większą stabilnością naszego SPIO/CTS BCNC w środowisku wodnym wynikającą z ochrony przeciw agregacji, jaką CTS daje nanocząstkom SPIO. Doskonałe działanie przeciwbakteryjne w stosunku do zastosowanych gatunków bakterii, nawet przy niskim stężeniue3O4, obserwowane w otrzymanych roztworachkoloidalnych SPIO/CTS BCNC, czyni te ostatnie idealnymi do nowych ekonomicznych zastosowań przemysłowych o długotrwałym działaniu. Stwier

dzono silne działanie przeciwbakteryjne roztworów koloidalnych Fe3O4/CTS BCNC wobec bakterii Gram-ujemnych P aeruginosa i E. coli na płytkach z MH po 24 h przy różnych stężeniach nanocząstek magnetytu. Zatem SPIO/CTS BCNC mogłyby być odpowiednie do zastosowań antymikrobiologcznych i do urządzeń biomedycznych.

Na podstawie wyników testów dyfuzyjno-krążkowych na agarze stwierdzono, że wszystkie filmy SPIO/CTS BCNC i nanocząstek SPIO wykazują istotne działanie hamujące wobec P aeruginosa (ATCC 27853) i E. coli (ATCC 25922). Na Rysunku 7 przedstawiono porównanie wyników testów średnicy strefy hamowania dla CIP (5 Ugdysk-1) jako antybiotyku standardowego, CTS (0,05 %mas.) jako próbki kontrolnej, SPIO/CTS BCNC i nanocząstek SPIO o zawartości 116 Ug Fe3O4.disc-1 na płytce z MH przeciw bakterii P aeruginosa. Średnice utworzonych stref hamowania w próbkach wyniosły średnio I6±Imm i I2±Imm odpowiednio w przypadku P aeruginosa i E. coli wskazując na przeciwbakteryjne działanie SPIO/CTS BCNC. Dla nanocząstek SPIO otrzymano wyniki I3±Imm i I0±Imm wobec odpowiednio P aeruginosa, i E. coli. Istotne jest, że skuteczność przeciwbakteryjna filmów SPIO/CTS BCNC wskazuje, że SPIO/CTS BCNC są odpowiedzialne za działanie przeciwbakteryjne w nanokompozycie polimerowym, i że działanie to jest silne. Podobnej średnicy strefy hamowania nie stwierdzono na filmie CTS (0,05%, to jest poniżej wartości MIC) jako próbce kontrolnej wobec którejkolwiek bakterii. Jak wspomniano testy kontrolne przeprowadzono dla porównania również w obecności znanych antybiotyków standardowych (CIP) (Rys. 7). Uzyskane wyniki zestawiono w Tablicy I.

Jest kilka czynników, które powodują bakteriobójczość badanych obecnie nanocząstek SPIO. Główny mechanizm, według którego działają leki antybakteryjne i antybiotyki, to stres oksydacyjny wywoływany przez ROS [67]. ROS, w tym rodniki nadtlenkowe (O2-), rodniki hydroksylowe (OH), nadtlenek wodoru (H2O2) i tlen singletowy (IO2), mogą uszkadzać białka i DNA w bakteriach [68]. Park i wsp.

również wykazali działanie przeciwbakteryjne srebra spowodowane wytwarzaniem ROS [69]. W tym przypadku tlenek metalu Fe3O4 mógł być źródłem generującym ROS i przez to hamującym rozwój P. aeruginosa i E. coli. Podobny proces opisali Keenan i wsp., gdzie Fe2+ reagował z tlenem tworząc nadtlenek wodoru [70]. Powstały H2O2 następnie reagował z jonami żelazawymi w reakcji Fentona tworząc rodniki hydroksylowe, które uszkadzają makrocząsteczki biologiczne [56,71]. W innych badaniach pokazano, że małe rozmiary nanocząstek mogą również przyczyniać się do efektu bakteriobójczego. Na przykład Lee i wsp. donieśli, że inaktywacja E. coli przez nanocząstki żelaza o zerowej wartościowości [72] mogła być wynikiem penetracji małych cząstek o rozmiarach 10-80 nm w błony E. coli. Nano-Fe0 mogło następnie reagować z tlenem międzykomórkowym prowadząc do stresu oksydacyjnego i ostatecznie powodując rozerwanie błony komórkowej. Jednak stosowanie nano-Fe0 ograniczać będzie obniżenie jego działania bakteriobójczego wskutek korozji oksydacyjna [72]. W kilku innych badaniach nad nanocząstkami ZnO i MgO stwierdzono, że działanie przeciwbakteryjne wzmagało się wraz ze zmniejszaniem się wielkości cząstek [56,73^75].

Wnioski

Opracowano jednonaczyniową metodę współstrącania do wytwarzania stabilnej wodnej zawiesiny zdyspergowanych nanostruktur Fe3O4 typu rdzeń-otoczka o silnym działaniu przeciwbakteryjnym i właściwościach superparamagnetycznych w obecności CTS o małej masie cząsteczkowej jako środka zabezpieczającego i matrycującego w temperaturze pokojowej. Wykazano możliwość efektywnego zwiększania skali bezpośredniego przetwarzania i produkcji dzięki sporządzonym kompozytowym nanocząstkom CTS o małejmasie cząsteczkowej może skutecznie i długotrwale chronić nanocząstki przed agregacją w rezultacie elektrostatycznego odpychania dodatnio naładowanych nanocząstek. Efekt działania nanokompozytów był szczególnie widoczny wobec szczepów Gram-ujemnych. To wzmożone działanie przeciwbakteryjne wynika z większej stabilności nanokompozytu jako koloidu i zatrzymywania rozwoju bakterii. Chitozan oddziałuje łatwo na bakterie i wiąże się z DNA, glikozaminoglikanami i większością białek, przez co wzmacnia efekt antymikrobiologiczny nanocząstek. Stężenie Fe3O4, przy którym następuje całkowite zahamowanie rozwoju bakterii wyniosło tylko 40 jUg.ml-i dla P. aeruginosa i 45 /ig.ml"1 dla E. coli i było znacznie niższe od podawanego w raportach innych badaczy. Istotne jest, że skuteczność przeciwbakteryjna filmów SPIO/CTS BCNC wskazuje, że SPIO/CTS BCNC są odpowiedzialne za działanie przeciwbakteryjne w nanokompozycie polimerowym i że działanie to jest silne. Powyższe zalety wodnych dyspersji nanocząstek magnetytu czynią je przydatnymi do zastosowań przemysłowych, medycznych i do opracowywania nowatorskich środków antymikrobiologicznych. Środki te mogą znaleźć zastosowanie w antymikrobiologicznych materiałach opakowaniowych i środkach opatrunkowych. Z drugiej strony właściwości magnetyczne tych nanostruktur wykorzystano do ich skutecznego wyodrębnienia z medium za pomocą zewnętrznego pola magnetycznego i zapobieżenia skażeniu środowiska naturalnego przy usuwaniu odpadów.

Literatura

1. Shrifian-Esfahani A., Salehi M.T., Nasr-Esfahani M., Ekramian E., Nano-sci J.: Nanotechnol. 2012, 12, 4851.
2. Zhao L., Mitomo H., Zhai M., Yushii F, Nagasawa N., Kume T: Carbo-hydrate Polym. 2003, 53, 439.
3. Kumar M., Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Sashiwa H., Domb A.J.: Chemical Reviews 2004, 104, 6017.
4. Kim E.H., Ahn Y., Lee H.S.: Journal of Alloys and Compounds 2007, 434, 633.
5. Rejane C.G., Douglas B., Odilio B.G.A.: PolŃTieros, Ciśncia e Tecnologia 2009, 19, 241.
6. Assis O.B.G., Pessoa J.D.C.: Braz. J. Food Technol. 2004, 7, 17.
7. Liu G.F, Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D.: J. Appl. Polymer Sci. 2001, 79, 1324.
8. Chen C.S., Liau W.Y., Tsai G.J.: J. Food Prot 1998, 61, 1124.
9. Juntarapun K., Satirapipathku C.: The 4th RMUTP International Confe-rence: Textiles & Fashion. Bangkok Thailand. Section II 2012, i.
10. Muzzarelli A. A.: In natural chelating polymer. Pergamon Press Ltd., Hungary. 1973.
11. Jovancic D., Jocic D., Molina R., Erra P: Text. Res. J. 2001,71,948.
12. Vimala K., Mohan Y.M., Varaprasad K., Redd N.N., Ravindra S., Naidu N.S., Raju K.M., Biom J.: Nanobio. 20ii, 2, 55.
13. Twu Y.K., Chen Y.W., Shih C.M.: Powder Technol. 2008, 185, 25i.
14. Niemirowicz K., Markiewicz K.H., Wilczewska A.Z., Car H.: Advances in Medical Sciences 20i2, 57, i96.
15. Lattuada M., Hatton T.A.: Langmuir 2007, 23, 2i58.
16. Zhou Y.T, Nie H.L., Branford-White C., He Z.Y, Zhu L.M.: J. Colloid and Interface Science 2009, 330, 29.
17. Dave S.R., Gao X.: Nanomedicine and Nanobiotechnology 2009, 1, 583.
18. Ana L., Silva D., Tito T: w Advances in Nanocomposite Technology. Edited A. Hashim , Publisher InTech 20ii, s. 285.
19. Ma M., Zhang Y., Yu W., A: Physicochem. Eng. Aspect. 2003, 212, 2i9.
20. Schwarzer H.C., Peukert W.: Chemical Engineering Communications 2004, i9i, 580.
21. Jolivet J.P, Chaneac C., Tronc E.: Chem. Commun. 2004, 10, 48i.
22. Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Vander L., Elst L.V, Muller R.N.: Chem. Reviews 2008, 108, 2064.
23. Lee J., Isobe T, Senna M.J.: Colloid & Interface Sci. i996, 177, 490.
24. Park J.W., Park M.O., Park K.K.: Bull, Korean Chem. Soc. i984, 5, i08.
25. Ge Y, Zhang Y., He S., Nie F, Teng G., Gu N.: Nanoscale Research Letters 2009, 4, 287.
26. Liu X., Hu Q., Fang Z., Zhang X., Zhang B.: Langmuir 2009, 25, 3.
27. Prasad S.K., Kumar S.L., Prasad M., Jayalakshmi B., Revanasiddappa H.D.: Biointerface Res. Appl. Chem. 20ii, 1, i27.
28. Kaittanis C., Nath S., Perez J.M.: PLo.S. ONE 2008, 3, 3253.
29. Taylor E.N., Webster T.J.: Int. J. Nanomedicine 2009, 4, i45.
30. Tran N., Mir A., Mallik D., Sinha A., Nayar S., Webster T.J.|: International Journal of Nanomedicine 20i0, 5, 277.
31. Touati D.: Arch. Biochem. Biophys. 2000, 373, i.
32. Pareta R.A., Taylor E.N., Webster T.J.: Nanotechnology 2008, 19, 265i0i.
33. Hoiby N., Bjarnsholt T, Givskov M., Molin S., Ciofu O.: International Journal of Antimicrobial Agents 20i0, 35, 322.
34. Suarez C., Pena C., Tubau F, Gavalda L., Manzur A., Dominguez M.A., Pujol M., Gudiol F, Ariza J.: Journal of Infection. 2009, 58, 285.
35. Church D., Elsayed S., Reid O., Winston B., Lindsay R.: Clinical Micro-biology Reviews. 2006, 19, 403.
36. Ferry S.A., Holm S.E., Stenlund H., Lundholm R., Monsen T.J.: Scandi-navian Journal of Infectious Diseases 2004, 36, 296-30i.
37. Kahlmeter G.: The ECO.SENS Project: Journal of Antimicrobial Che-motheraphy 2000, 46, i5.
38. Bouza E., San Juan R., Munoz P, Voss A., Kluytmans J.: Clinical Micro-biology and Infections 200i, 7, 523.
39. In EUCAST disk diffusion method for antimicrobial susceptibility te-sting. European society of clinical microbiology and infectious diseases Reading guide 20i3 Version 3, 3.
40. Cullity B.D.: Elements of X-ray diffraction. Adison-Wesley, Reading MA i978.
41. Silva S. M. L., Braga C. R.C., Fook M. V. L., Raposo C. M.O., Carvalho L. H., Canedo E. L.: w Application of infrared spectroscopy to analysis of chitosan/clay nanocomposites. Infrared spectroscopy - materials science, engineering and technology. red. Theophanides Theophile, InTech, 20i2.
42. Montafiez J. L. A.: Polysaccharide-based nanostructures for growth fac-tor delivery and mesenchymal stem cell activation. Praca doktorska, Colorado State University20ii, 80.
43. Xu Y., Kim K., Hanna M.: D. Nag. Industrial Crops and Products. 2005, 21, i85.
44. Kolhe P, Kannan R.M.: Biomacromolecules 2003, 4, i73.
45. E. de Souza Costa-Junior, Pereira M.M., Mansur H.S., Mater J. Sci.: Ma-ter. Med. 2009, 20, 553.
46. Krishna Rao K.S.V, Vijaya Kumar Naidu B., Subha M.C.S., Sairam M., Aminabhavi TM.: Carbohydrate Polymers 2006, 66, 333.
47. Ramya R., Sudha PN., Mahalakshmi J.: International Journal of Scientific and Research Publications 2012, 2, 1.
48. Paluszkiewicz C., Stodolak E., Hasik M., Blazewicz M.: Spectrochimica Acta Part A. 2011, 79, 784.
49. Darder M., Colilla M., Ruiz-Hkzky E.: Applied Clay Science 2005, 28, 199.
50. Yuan Q., Shah J., Hein S., Misra R.D.K.: Acta Biomaterialia 2010, 6, 1140.
51. Hong S., Chang Y., Rhee I.: Journal of the Korean Physical Society 2010, 56, 868.
52. Wang Y, Li B., Zhou Y., Jia D.: Nanoscale Res. Lett. 2009, 4, 1041.
53. Ahmad S., Riaz U., Kaushik A., Alam J., J. Inorg. Organomet. Polym. 2009, 19, 355.
54. Carotenuto G.: Appl. Organometal. Chem. 2001, 15, 344.
55. Wang B., Wei Q., Qu S.: Int. J. Electrochem. Sci. 2013, 8, 3786.
56. Tran N., Mir A., Mallik D., Sinha A., Nayar S., Webster T.J.: International Journal of Nanomedicine 2005, 5, 277.
57. Mandal M., Kundu S., Ghosh S.K., Panigrahi S., Sau T.K., Yusuf S.M., Pal T: J. Colloid Interface Sci. 2005, 286, 187.
58. Yuqing G.Y, Shiying H., Fang N., Gaojun T, Ning G.: Nanoscale Res. Lett. 2009, 4, 287.
59. Berry C.C., Curtis A.S.G.: J. Phys. D. Appl. Phys. 2003, 36, 198.
60. No H.K., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P: Int. J. Food Microbial. 2002, 74, 65.
61. Balicka-Ramisz A., Wojtasz-Pajak B., Pilarczyk A., Ramisz L.L.: w Proce-edings of 5th international conference on chitin and chitosan. Warsaw 2005, 406.
62. Fernandes J.C., Tavaria F.K., Soares J.C., Ramos O.S., Monteiro M.J., Pintado M.E., Malcata F.X.: Food Microbiol. 2008, 25, 922.
63. Behera S.S., Patra J.K., Pramanik K., Panda N., Thatoi H.: World Journal of Nano Science and Engineering 2012, 2, 196.
64. Xiao L.H., Wang T, Zhao TY, Zheng X., Sun L.Y, Li P, Liu F.Q., Gao G., Dong A.: Int. J. Mol. Sci. 2013, 14, 7391.
65. Shariatinia Z., Nikfar Z.: International Journal of Biological Macromo-lecules 2013, 60, 226.
66. Senthil M., Ramesh C.: Digest Journal of Nanomaterials and Biostruc-tures. 2012, 7, 1655.
67. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Hayete B., Lawrence C.A., Collins J.J.: Cell. 2007, 130, 797.
68. Sies H.: Exp. Physiol. 1997, 82, 291.
69. Park H.J., Kim J.K., Kim J.: Water Res. 2009, 43, 1027.
70. Keenan C.R., Sedlak D.L.: Environ Technol. 2008, 42, 1262.
71. Touati D.: Arch Biochem Biophys. 2000, 373, 1.
72. Lee C., Kim J.Y., Lee W.I., Nelson K.L., Yoon J., Sedlak D.L.: Environ Technol. 2008, 42, 4927.
73. Zhang L., Jiang Y., Ding Y., Povey M., York D.: J. Nanopart. Res. 2007, 9, 479.
74. Yamamoto O.: Inter. J. Inorg. Mater. 2001, 3, 643.
75. Makhluf S., Dror R., Nitzan Y., Abramovich Y., Jelinek R., Gedanken A.: Adv. Funct. Mater. 2005, 15, 1708.
×

DALSZA CZĘŚĆ ARTYKUŁU JEST DOSTĘPNA DLA SUBSKRYBENTÓW STREFY PREMIUM PORTALU WNP.PL

lub poznaj nasze plany abonamentowe i wybierz odpowiedni dla siebie. Nie masz konta? Kliknij i załóż konto!

SŁOWA KLUCZOWE I ALERTY

Zamów newsletter z najciekawszymi i najlepszymi tekstami portalu

Podaj poprawny adres e-mail
W związku z bezpłatną subskrypcją zgadzam się na otrzymywanie na podany adres email informacji handlowych.
Informujemy, że dane przekazane w związku z zamówieniem newslettera będą przetwarzane zgodnie z Polityką Prywatności PTWP Online Sp. z o.o.

Usługa zostanie uruchomiania po kliknięciu w link aktywacyjny przesłany na podany adres email.

W każdej chwili możesz zrezygnować z otrzymywania newslettera i innych informacji.
Musisz zaznaczyć wymaganą zgodę

KOMENTARZE (0)

Do artykułu: Superparamagnetyczne nanocząstki tlenku żelaza modyfikowane chitozanem: projektowanie, wytwarzanie, opis i działanie przeciwbakteryjne

NEWSLETTER

Zamów newsletter z najciekawszymi i najlepszymi tekstami portalu.

Polityka prywatności portali Grupy PTWP

Logowanie

Dla subskrybentów naszych usług (Strefa Premium, newslettery) oraz uczestników konferencji ogranizowanych przez Grupę PTWP

Nie pamiętasz hasła?

Nie masz jeszcze konta? Kliknij i zarejestruj się teraz!